人工智能的飛速發展爲生物學研究帶來了深遠影響，其中，AlphaFold2在蛋白質結構預測領域引發了革命性的突破。本文評估了AlphaFold2對GPCR結構預測的可靠性，發現其雖能準確捕捉GPCR整體骨架的主要特徵，但在胞外域與跨膜域的組裝、配體結合口袋的形狀以及信號傳導界面的構象等方面，與實驗解析的高分辨率結構存在顯著差異。這些差異限制了其在GPCR功能研究和基於結構的藥物設計中的應用能力。因此，AI結構預測尚不能完全取代實驗結構生物學，需要聯合使用以輔助藥理學研究和藥物設計。
AlphaFold是由DeepMind開發的AI模型，能夠根據蛋白質的氨基酸序列預測其三維結構。蛋白質就像是生命體內的小機器，它們的結構決定了功能。瞭解蛋白質的結構對於藥物研發和理解生命過程非常重要。AlphaFold的出現，讓人們看到了快速預測蛋白質結構的可能性。
截至目前，AlphaFold的3個主要版本分別是AlphaFold1、AlphaFold2和AlphaFold3，各自代表了從基礎探索，到高精度預測和複合體建模的逐步演進（表1）。
表1 3代AlphaFold的核心差異對比
傳統上，結構生物學使用實驗手段來解析蛋白質的三維結構，主要的方法有以下幾種：
X射線晶體學：是最早且最常用的方法。研究者需要首先讓蛋白質形成晶體，然後用X射線照射這些晶體，得到衍射圖樣。通過解析這些圖樣計算出蛋白質的三維結構。但這一過程非常複雜，需要大量的時間和精力，尤其是培養出合適的蛋白質晶體並不容易，並且某些蛋白質無法在任何條件下結晶，這限制了晶體學對蛋白結構的研究。
核磁共振（NMR）：這種方法利用了原子核在磁場中的特性。研究者將蛋白質溶解在溶液中，放入強大的磁場中，然後測量原子核的信號。通過這些信號，可以推斷出蛋白質的結構和動態信息。但NMR適用於研究小型蛋白質，對於分子量較大的蛋白複合體並不適用。
冷凍電子顯微學（Cryo-EM）：這是近年來迅速發展的技術，將蛋白質快速冷凍保持天然狀態，在電子顯微鏡下觀察。總體上精度不如晶體學研究，僅部分結構達到近原子分辨率。適合研究大型蛋白質複合物，不過設備昂貴，操作要求高。
這些傳統方法雖精確可靠，但過程繁瑣、耗時耗力，需要豐富經驗和技術支持。AlphaFold出現後，有人思考傳統實驗方法是否還有必要。實際上，AlphaFold存在侷限性，如對蛋白質動態變化預測能力有限，預測複合物結構仍面臨挑戰，其預測結果常需實驗確認。
儘管GPCR的重要性不言而喻，但由於其高度複雜的結構和在激活時產生的顯著動態變化（圖1），解析GPCR的高分辨率結構一直是生物學上的重大挑戰。傳統的X射線晶體學技術和近年來興起的Cryo-EM技術雖然取得了一些突破，但獲得高分辨率的GPCR結構仍然是一個耗時且成本高昂的過程。這一技術瓶頸限制了我們對GPCR功能的深入理解，也在新藥開發中形成了障礙。
不過，當GPCR帶上大型細胞外結構（ECD）時，AlphaFold2的預測誤差通常會增大。因爲ECD和跨膜區域（TMD）之間的相對位置預測不夠準確，如結合了semaglutide的胰高血糖素樣肽-1受體（GLP1R），整體誤差達3.92Å。在甲狀旁腺激素2受體（PTH2R）和激活態的黃體生成素/絨毛膜促性腺激素受體（LHCGR）中，也出現整體RMSD大於分開計算的RMSD的情況。對於在訓練集中不常見的失活態LHCGR，整體RMSD竟然達到了6.08Å，差異極大（見圖2）。
本文評估的29個GPCR結構中有4個是與小分子配體結合的受體。結果顯示，AlphaFold2預測的GPCR主鏈結構與實驗數據相似（平均主鏈RMSD僅爲0.89Å），但關鍵殘基側鏈差異顯著，側鏈RMSD高達1.90Å，整體原子RMSD爲1.52Å。使用基於AlphaFold2預測結構的分子對接評估發現，大部分對接不能重現結果（見圖3）。
在GPCR的世界中，TM6和TM7這2段跨膜螺旋就像是細胞信號傳遞中的關鍵“交通樞紐”，會根據需要進行動態調整，爲重要的下游信號分子（如G蛋白等）提供暢通的“通行路徑”。然而，實驗結構和預測模型在這些關鍵“路段”上往往存在顯著差異，AlphaFold2在預測這些變化時也確實面臨挑戰，相關結果在圖4中展示。
研究發現，有些GPCR在預測模型中的TM6-TM7構象與實驗結果有較大出入，誤差超過了2Å。例如，在ghrelin受體和抗利尿激素受體（V2R）的“地圖”中，這些關鍵“路段”的偏差分別達到了3.08Å和2.83Å。在GLP1R和PTH2R的模型中，TM6和TM7被預測爲“向上抬升”，影響小分子無法正確“到達”結合位點。
同樣地，細胞內區域的情況也值得關注（圖5）。通過測量TM6的開啓程度，我們可以瞭解這些GPCR在細胞內側爲蛋白結合夥伴預留的“通行空間”有多大。有趣的是，不同類型的GPCR在預測模型中預留的“空間”差異明顯。對於沒有結合G蛋白的A類GPCR，預測結構中預留的“空間”比實驗結構更多。而對於已經結合了G蛋白的A類GPCR，預測結構中預留的“空間”卻更少。B1類GPCR的預測模型與實驗結構幾乎一致，可能是訓練數據中激活態B類GPCR結構較多。此外，某些A類GPCR的胞內環區3（ICL3）在預測模型中與實驗結構差異大，如5HT1FR和膽囊收縮素受體1（CCKAR）。
圖5 AlphaFold2預測模型和電鏡結構在胞內關鍵激活螺旋（TM6）上的對比
預測與小分子結合的GPCR結構時，雖主鏈預測準確度約1Å左右，但預測與配體相互作用的“結合口袋”結構時仍面臨挑戰。更糟糕的是，在LHCGR案例中，預測模型甚至未形成適合小分子對接的“停靠點”。
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